Alkoholdehydrogenase der Gruppe III aus Pectobacterium atrosepticum: Einblicke in die enzymatische Aktivität und Organisation der metallionenhaltigen Region

Zusammenfassung

NAD(P)(+)-abhängige Alkoholdehydrogenasen (ADH) sind in allen Phyla weit verbreitet. Diese Proteine ​​lassen sich drei nicht-homologen Isoenzymgruppen zuordnen, wobei Gruppe III hinsichtlich katalytischer Aktivität und Primärstruktur eine hohe Diversität aufweist. Mitglieder der Gruppe III besitzen eine konservierte Aminosäuresequenz, die für die Cofaktorbindung und Metallionenkoordination wichtig ist, während die Sequenzidentitäten der vollständigen Proteine ​​sehr hoch sind (90 %). Eine mutmaßliche Gruppe III ADH, PaYqhD, wurde mittels BLAST-Analyse aus dem pflanzenpathogenen Enterobakterium Pectobacterium atrosepticum identifiziert. Das PaYqhD-Gen wurde im heterologen Wirt Escherichia coli exprimiert, und das rekombinante Protein wurde in einem zweistufigen Reinigungsverfahren bis zur Homogenität aufgereinigt, was auf eine obligate Dimerisierung der Monomere hindeutet. Vier konservierte Aminosäurereste, die an der Metallionenkoordination beteiligt sind, wurden durch Alanin substituiert. Ihre Bedeutung für die katalytische Aktivität wurde mittels Circulardichroismus-Spektroskopie, In-vitro-Experimenten und Wachstumsstudien bestätigt. PaYqhD zeigt optimale Aktivität bei 40 °C mit kurzkettigen Aldehyden und NADPH als Cofaktor, was darauf hindeutet, dass es sich um eine Aldehydreduktase handelt. Oxidative Aktivitäten gegenüber alkoholischen Verbindungen waren nicht nachweisbar. EDTA hemmte die katalytische Aktivität vollständig; die Zugabe von Co²⁺ führte zu einer vollständigen Wiederherstellung. Aktivitätsmessungen, Sequenzvergleiche und Strukturanalysen bestätigten, dass PaYqhD zu den Butanoldehydrogenase-ähnlichen Enzymen der Gruppe III der Aldehyddeduktasen (ADHs) gehört.